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　　非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种高度接触传染性、广泛出血性猪病毒病，死亡率可高达 100%，无商品化疫苗可用。自今年 8 月初我国爆发*非洲猪瘟疫情以来，截至 11 月 5 日，短短三个月时间里，已有 14 个省累计爆发 58 起疫情，扑杀生猪近 50 万头，直接经济损失数十亿元，给我国养猪业造成了巨大冲击。面对来势汹汹的非洲猪瘟疫情，我国的应对是果断有力的，但也面临种种挑战。

　　【产品名称】

　　通用名称：病毒DNA提取试剂盒

　　英文名称：Extraction Kit for Virus DNA

　　【预期用途】

　　本试剂盒主要用于疑似病毒等病原感染抗凝血、血淸、拭子、组织、饲料及环境中的病毒DNA的提取，纯化的核酸可适用于各种常规操作及PCR试验。

　　【试剂盒组分】

　　I、试剂盒组成及贮藏条件

　　2、 保存条件及有效期：室温下保存，有效期12个月.

　　3、 需自备材料：无水乙醇、1.5 mL无菌离心管、1.5 mL无菌离心管(长臂型)、生理盐水、研钵、无菌

　　1mL, 2OOuL、10uL枪头、记号笔等。

　　【操作步骤】

　　一、样品制备

　　1、 血液样品：抗凝血样品置离心管中，8000转/分钟离心2分钟，取上层血浆;非抗凝血样品置离心 管中，待凝固后，8000转/分钟离心2分钟，取上层血清，置于灭菌离心管中，编号待检。

　　2、 组织样品：采集脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体等病变组织样品0.1g.组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入1 mL生理盐水混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心骨中，编号待检。

　　3、 口腔液：进食前用拭子/口腔液采集袋或自制棉线绑纱布团吸引动物咀嚼，收集口腔液大于 500uL， 8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检。

　　4、 饲料：取适量研磨后的饲料(约0.2g)，放入含1 mL生理盐水或PBS(PH为7.4)缓冲液的2 mL EP 管屮，振荡混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中,编号待检.

　　5、 灰尘：用无菌棉签蘸取适量环境表面上的灰尘，放入含1 mL生理盐水或PBS(PH为7.4)缓冲液的2 mL EP管中，振荡混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检。

　　二、DNA的提取

　　1、取裂解液200uL加入无核酸酶1.5 mL离心曾屮，分别加入血浆/血清/组织液等样品液200uL. 震荡混匀10秒或颠倒混匀10次，室温放置5分钟(如果室内温度较低时.需放置25C水浴温育)，再加入200uL无水乙醇，颠倒混匀10秒;若样品浑浊则先12000转/分钟离心1分钟处理，取上清液，以避免堵塞柱子;

　　2、 将液体转入套有收集管的吸附柱中， 12000rpm离心1分钟：

　　3、 弃收集管液体，向吸附柱中加600uL洗液I , 12000 rpm离心1分钟;

　　4、 弃收集管液体，向吸附柱中加600uL洗液II， 12000 rpm离心I分钟;

　　5、 弃收集管液体，12000 rpm离心2分钟，以*去除残留洗液;

　　6、将吸附柱转入新的无核酸酸1.5mLEP管(长臂型)中，向柱中央滴加50 uL洗脱液，静置1分钟, 12000 rpm离心1分钟，EP管中液体即为病毒DNA。

　　【注意事项】

　　1、 实验前诺仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行.在操作过程中对时间、试剂体积等 粘确控制可以获得好的结果。

　　2, 样本应新鲜采集使用，或低温运输储存;

　　3, 样本具有潜在感染风险，核酸的提取应在核酸提取实验室的生物安全柜中进行。

　　4、 核酸提取冇关耗材确保高温灭菌，提取后核酸尽快进入下一步试验或冷冻保存待用。

　　5, 试剂使用前应混合均匀，试剂具有一定腐蚀性，使用时请戴手套、口罩做好防护。

　　6. 低温下裂解液出现结晶数属正常现象，可在60°C水浴加热助溶后使用。

　　7、 实验产生的废弃物应及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理。

　　仅供兽医诊断使用

　　非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒说明书

　　【兽药名称】

　　通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒

　　汉语拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

　　英文名称：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

　　商品名称：无

　　【主要成分与含量】试剂盒中含有如下组分:

　　【用法与判定】

　　1 用法

　　1.1待检样品釆集、保存及运输

　　1.1.1样品釆集

　　(1) 活猪样品 无菌采集抗凝血或血清5mL

　　(2) 病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品 无菌采集死猪的牌、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2〜8°C低温运至实验室用于检测。

　　(3) 病猪污染的周边环境 采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。2〜8°C低温运至实验室用于检测。

　　1.1.2样品保存 采集的样品在2〜8°C保存应不超过24小时，-70°C条件下保存，避免反复冻 融。

　　1.1.3样品运输泡沫箱加冰袋后密封进行运输。包装和运输应符合农业农村《高致病性动 物病原微生物菌(毒)种或者样品运输包装规范》和交通运输门关于危险品运输管理的有关规定。

　　1.2样品处理

　　1.2.1血液样品处理 抗凝血样品置于离心管中，8000 r/min离心2分钟取上层血浆，编号待 检。非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，8000 r/min离心2分钟取200μL上层血清，编号待检。

　　1.2.2组织样品处理取适量脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肌肉等组织，置于研磨器或研磨管中研磨，再加适量生理盐水混匀，制成约10%的组织匀浆，8000 r/min离心2分钟，取200μL上 清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。

　　1.2.3环境样品处理

　　1.2.3.1粪便、饲料样品处理方法取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中研磨混匀，制成约10%的匀浆液.8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心 管中，编号备用。

　　1.2.3.2污水样品处理方法 直接取200μL污水进行核酸提取。

　　1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法进行DNA核酸提取。

　　1.4荧光PCR反应：

　　1.4.1从试剂盒中取出荧光PCR反应液、酶混合液，室温融化后，2000 r/min离心5秒。设被 检样品、阳性对照和阴性对照总和为n,则反应体系配制如下：

　　试剂 体系

　　PCR 反应液 17× (n+1) μL

　　酶混合液 3× (n+1) μL

　　1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20μL/ 管分装量将试剂分装至荧光PCR反应管。

　　1.4.3在上述制备好的荧光PCR反应管中分别加入阴性对照、阳性对照各5μL、处理好的待测核酸各5μL,终体积25μL/管，盖好荧光PCR反应管盖，混匀后瞬时离心，转移到荧光PCR仪器 上。

　　144将PCR反应管放置在荧光PCR仪样品槽中，在荧光PCR仪上运行以下程序：

　　荧光通道选择FAM,在PCR扩增阶段每个循环的55℃时采集荧光信号。设置扩增体系为25μL, 同时要选择passive reference和quencher为none的模式。(注：若荧光PCR仪(如AB17500)按说明 书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行，可将预扩增和PCR扩增条件变更为95C： 5秒 55°C： 30 秒)

　　2结果判定

　　2.1试验有效性判定

　　阳性对照有典型扩增曲线且Ct值≤30.且阴性对照无Cl值或无扩增曲线，线形为直线或轻微斜线，无指数增。则判试验结果有效。否则，此次试验视为无效。

　　2.2样品判定

　　2.2.1阳性：样本检测结果Ct值≤35且有明显指数增，判定检出非洲猪瘟病毒核酸。

　　2.2.2可疑：样本检测结果Ct值在35〜38范围内。此时应对样本进行重复检测，如果重复实验 结果Ct值仍在35〜38范围内，有明显指数增.则判定为阳性，否则为阴性。

　　2.2.3阴性：样本检测结果Ct值>38或无Ct值，判定未检出非洲猪瘟病毒核酸。

　　【注意事项】(1)实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过 程中对时间、试剂体积等准确控制可以获得好的结果。

　　(2) 实验室应严格按照有关规定分区管理，依照配液区-模板提取区-扩增区-分析区顺序 进行基因检测。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求。

　　(3) 核酸提取有关耗村确保洁净、无DNase/RNase,提取过程尽量低温、快速，完成后进入 下一步实验或冻保。

　　(4) 对于顶采光仪器要带新的一次性PE手套对荧光PCR管封盖，对于底采光仪

　　器要避免徒手或使用过的手套接触荧光PCR管底，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套。

　　(5) 冻存试剂使用前应于室温下*融化，瞬时离心使液体*沉于管底。避免反复冻融， 以免影响试剂性能。

　　(6) 样品、阳性对照等在使用后及时封盖，.避免组分间及气溶胶等的污染造成假阳性。

　　(7) 扩增产物禁止开盖，实验产生的废弃物应及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理。

　　【规格】50头份/盒

　　【贮藏与有效期】试剂盒置-20°C以下避光保存，有效期12个月。

　　【批准文号】兽药生字163668871